Жидкие биопсии и выявление мутации гена EGFR
12.07.2017
Определение мутаций гена EGFR при немелколеточном раке легкого (НМРЛ) стало стандартом современной онкологии, поскольку назначение ингибиторов тирозинкиназ (ИТК) 1-го и последующих поколений позволило существенно увеличить срок жизни ранее малокурабельных пациентов. Применение жидкой биопсии позволяет разрешить некоторые проблемы с выявлением такой мутации.
Ирина Анатольевна Демидова, к.м.н., заведующая лабораторией молекулярной биологии ГБУЗ «МГОБ No62 ДЗМ»
Получение достаточного количества опухолевой ткани для проведения адекватного тестирования и выявления мутации до сих пор остается серьезным препятствием для назначения современного лечения. От 20 до 30% нуждающихся пациентов не могут подвергнуться инвазивным методам диагностики по причине сложного расположения опухоли или своего тяжелого состояния [1].
Привлекательный источник опухолевого материала в такой ситуации — циркулирующие в крови пациента опухолевые клетки (CTC — circulating tumor cells, ЦОК) и опухолевая ДНК (cfDNA — circulating free DNA, цоДНК). Их источник — опухолевые очаги, как первичные, так и метастатические (рис. 1). Выделение как ЦОК, так и цоДНК из большого числа биологических жидкостей (кровь, моча, слюна) получило название «жидкая биопсия».
Новые открытия в геномике злокачественных опухолей не только существенно обогатили наше понимание этиологии и патогенеза онкологических заболеваний, но и значительно изменили алгоритмы диагностики, что, в свою очередь, во многом изменило традиционную лечебную тактику и привело к ранее невозможным успехам в лечении ряда заболеваний.
Срок их жизни в циркуляции короток (как правило, не превышает суток), однако при соблюдении необходимых условий, о которых будет упомянуто ниже, вполне достаточен для получения адекватного количества опухолевого материала. Как ЦОК, так и цоДНК имеют свои преимущества и недостатки в зависимости от задач исследователя (табл. 1).
Учитывая крайне малое количество ЦОК и существенную дороговизну их получения, наиболее приемлемым для практического использования считается цоДНК.
Учитывая крайне малое количество ЦОК и существенную дороговизну их получения, наиболее приемлемым для практического использования считается цоДНК.
Циркулирующая опухолевая ДНК
Феномен внеклеточной циркулирующей ДНК (цДНК) впервые описан в 1948 г. Прак- тически у любого здорового человека возможно выявить цДНК, причем ее количество существенно увеличивается после физической нагрузки, а также превышает обычные значения при беременности у пациентов с опухолевыми заболеваниями [3]. Как правило, цДНК представляет собой короткие фрагменты — продукты как здоровых тканей, так и опухолевых клеток [4]. Интересно, что опухоль, содержащая около 50 млн клеток, выделяет достаточное для определения в крови количество цоДНК, в то время как позитронно-эмиссионная и компьютерная томография (ПЭТ- КТ) способна увидеть опухоль размером не более 7–10 мм, то есть содержащую около 1 млрд злокачественных клеток [1].
Безусловно, количество цоДНК напрямую зависит от опухолевой массы, проведенной те- рапии, оперативного вмешательства и так далее, причем ее количество может колебаться от 0,01 до 90% всей цДНК. Нам пока не до конца известны все закономерности колебаний количества цоДНК [5].
Однако совершенствование новых методов транспортировки, выделения цоДНК из плаз- мы, появление новых высокочувствительных методик детекции мутаций позволили говорить о возможности внедрения исследований цоДНК в клиническую практику.
Возможности использования цоДНК при НМРЛ
Использование цоДНК при НМРЛ имеет свои точки применения, достоинства и определенные сложности. Не стоит забывать, что биопсийный материал по-прежнему признается «золотым стандартом» диагностики, однако, как уже говорилось выше, получение его требует серьезных дорогостоящих манипуляций, иногда опасных для пациентов. Кроме того, современная обработка биопсийного материала ведет к выраженному повреждению ДНК, что может привести к невозможности выполнения анализа или появлению артифициальных мутаций [6]. Взятие образца из одного участка опухоли далеко не всегда отражает весь спектр генетических нарушений в связи с феноменом внутриопухолевой гетерогенности [7].
Наконец, повторные биопсии могут быть выполнены лишь у части пациентов при развитии прогрессирования и не могут быть часто использованы для контроля за течением болезни.
«Жидкие биопсии» лишены этих недостатков. ЦоДНК, выделенная из крови пациента с НМРЛ, не только позволяет провести первичное генетическое тестирование, но и отражает полный «генетический портрет» опухоли, так как несет информацию о структуре всех очагов поражения.
Забор крови для получения цоДНК дешев и безопасен для пациента и может проводиться с определенной периодичностью для исследования появления возможных мутаций резистентности еще до клинических признаков прогрессирования. Более того, в ряде случаев выявление мутаций резистентности (а именно Т790М) в первичных образцах может помочь доктору правильно выбрать тактику лечения с самого начала заболевания [8].
Проведенные в последние годы исследования подтверждают высокую конкордантность между мутационным статусом гена EGFR в парных образцах опухоли и цоДНК. Так, в исследовании Douillard et al. показана конкордантность мутационного статуса между опухолевыми образцами и цоДНК 94,3% с чувствительностью 65,7% и специфичностью 99,8% [9]. Похожие результаты получе- ны Mok et al. В их исследовании конкордантность между мутационным статусом гена EGFR в парных образцах опухоли и цоДНК составила 88%, чувствительность — 75%, специфичность — 96% [10]. Эти данные подтверждают возможность использования цоДНК в клинической практике.
Наиболее интересны результаты исследований, использующих цоДНК для изначального определения резистентности опухоли к терапии ИТК 1-го поколения с помощью выявления первичной мутации Т790М. Так, в рабо- те Wang et al. показана худшая выживаемость носителей мутации резистентности, получавших ИТК 1-го поколения, в сравнении с пациентами без Т790М, причем выживаемость пациентов ухудшалась с увеличением процента T790M+-клеток (рис. 2) [11].
Появление ИТК нового поколения, позволяющих эффективно бороться с мутациями резистентности, привело к необходимости периодического контроля за лечением, позволяющим как можно раньше назначить новый препарат и отслеживать его эффективность.
Именно исследования цоДНК показали свою значимость для этой цели, определяя динамику мутации резистентности раньше, чем стандартные методы исследования выявляли прогрессию заболевания (рис. 3).
Появление ИТК нового поколения, позволяющих эффективно бороться с мутациями резистентности, привело к необходимости периодического контроля за лечением, позволяющим как можно раньше назначить новый препарат и отслеживать его эффективность.
Именно исследования цоДНК показали свою значимость для этой цели, определяя динамику мутации резистентности раньше, чем стандартные методы исследования выявляли прогрессию заболевания (рис. 3).
Особенности работы с цоДНК
Конечно, успех работы с цоДНК связан с соблюдением определенных условий. Достаточно важное условие — правильный отбор пациентов. Пациенты с небольшой опухолевой массой, операбельные или имеющие единичные небольшие метастатические очаги, как правило, не несут достаточного для детекции количества опухолевой ДНК в циркуляции и чаще всего не могут быть достоверно обследованы с помощью поиска мутаций в биологических жидкостях в рутинных условиях. Для работы с такими пациентами требуются особо чувствительные методы детекции, возможно, большее значение имеет определение ЦОК. В обычной практике для них все же предпочтительнее биопсия [13, 14].
Следующее важное условие — правильная работа с кровью: она должна быть либо в течение часа доставлена в лабораторию, либо взята в пробирки со специальным консервантом, сохраняющим целостность цоДНК в течение длительного времени, либо из нее немедленно должна быть выделена плазма и правильно заморожена. Разрушение цоДНК происходит практически поминутно [15]. Кроме того, все больше исследователей соглашаются с необходимостью забора не менее 10 мл крови для обеспечения гарантированного получения достаточного количества цоДНК.
Далее уже в лаборатории цоДНК должна быть выделена наиболее оптимальным способом и исследована наиболее чувствительным методом, доступным исследователям. Ниже при- ведены наиболее распространенные методы с указанием их чувствительности (табл. 2).
К сожалению, далеко не все методы доступны в нашей стране в связи с их дороговизной или отсутствием регистрации. Однако наиболее зарекомендовавшие себя методы, включающие несколько видов ARMS-PCR и цифровой (digital) полимеразной цепной реакции (ПЦР), вполне доступны и используются лабораториями, входящими в программу Российского общества клинической онкологии «Совершенствование молекулярно-генетической диагностики в Российской Федерации». Таким образом, исследования цоДНК при НМРЛ могут быть внедрены для рутинной практики в ближайшее время и в нашей стране, после прохождения необходимых процедур стандартизации и валидации методик.
Список литературы находится в редакции.
НАШИ ПАРТНЕРЫ
